Роль дефицита альфа1-антитрипсина в развитии бронхолегочной патологии

Дефицит альфа₁-антитрипсина (А1АТ) – ​генетически детерминированное заболевание, вызванное недостаточностью А1АТ в сыворотке крови, возникающее вследствие различных мутаций в гене Pi и проявляющееся в виде хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), эмфиземы легких, идиопатического фиброза, бронхоэктазов, развития рака легкого, поражения печени и сосудов. 

Точная распространенность дефицита А1АТ в большинстве популяций не известна, и у многих он остается не диагностированным. Например, в США из 70-100 тыс. пациентов с признаками дефицита А1АТ идентифицированы только 10% [1], а в Европе из 125 тыс. лиц лишь приблизительно 5 тыс. включены в Международный регистр альфа‑1 (The Alpha One International Registry) [2]. В многочисленных исследованиях было показано, что срок установления диагноза составляет от 5,6 до 7,2 года с момента первого обращения к врачу. Это связано с тем, что у некоторых людей с очень низким уровнем этого белка не отмечаются клинические признаки заболевания, а симптомы различны или полностью отсутствуют. Кроме того, на проявление заболевания влияет не только генетическая предрасположенность, но и факторы окружающей среды. Распространенность дефицита А1АТ в мире не превышает 0,5-1% (наибольшая – ​1,8% – ​в странах Скандинавии). Дефицит А1АТ в организме человека является недооцененным заболеванием.

Физиологическая роль А1АТ

А1АТ имеет альтернативное название «ингибитор альфа‑1-протеиназы», или SERPINA1 (SERine Proteinase INhibitor), является членом суперсемейства ингибиторов сериновых протеаз (серпинов), которое состоит из альфа‑1-химотрипсина, ингибитора С1, антитромбина, нейросерпина и др. [3, 4]. А1АТ считается основной антиэластазой нижних дыхательных путей, в основе действия лежит способность ингибировать сериновую протеазу и нейтрофильную эластазу [5, 6]. Кроме антипротеазной активности, А1АТ обладает другими биологическими эффектами (модулирование воспаления), антиоксидантным и антимикробным действием, участвует в локальном иммунном ответе, препятствует апоптозу [7, 8]. Мутантные формы А1АТ играют важную роль в патогенезе заболеваний. Это связано с неправильным сворачиванием белка, аккумулированием этих форм в полимеры, что приводит к уменьшению секреции функциональных мономеров.

История открытия А1АТ

В 1963 г. ученые C.-B. Laurell и S. Eriksson из Лундского университета в Швеции обнаружили, что при электрофорезе белков сыворотки у лиц с панацинарной эмфиземой не было полосы для альфа‑1-глобулина [9, 10].

Через шесть лет, в 1969 г., H. Sharp и соавт. [11] установили связь между дефицитом А1АТ и цирротическими изменениями при поражении печени.

Структура и функциональная роль А1АТ

А1АТ представляет собой гликопротеин с молекулярным весом 52 кДа, который секретируется гепатоцитами и в меньшей степени другими тканями, включая эпителиальные клетки легкого, макрофаги, тубулярные клетки почек, кишечные эпителиальные клетки. А1АТ относится к быстросинтезируемым белкам (<90 мин), а период полувыведения составляет ~4-5 дней. Функция А1АТ заключается в ингибировании химотрипсина, панкреатической эластазы, коллагеназы кожи, ренина, урокиназы, фактора Хагемана и нейтральных протеаз нейтрофилов. Активная форма А1АТ состоит из 394 аминокислот и имеет сложное строение – ​три определенным образом упакованные β-структуры, девять α-спиралей и ингибиторный метионин реактивного центра (Met358). Взаимодействие А1АТ с протеазой начинается с того, что она подвергает атаке метионина реактивного центра ингибитора антитрипсина. Остаток метионина реактивного центра А1АТ служит «приманкой» для фермента. Образовавшийся комплекс претерпевает конформационные изменения, в результате которых протеаза погружается вглубь молекулы А1АТ и в дальнейшем активируется [12]. Распространяясь с кровотоком, А1АТ попадает в легкие путем диффузии через эндотелий и эпителиальные клетки. На поверхности бронхиального эпителия А1АТ определяется в количестве 10-15% от содержания в плазме. Данный белок присутствует в слезах, дуоденальной жидкости, слюне, выделениях из носа, спинномозговой жидкости, выделениях из легких, материнском молоке. Это острофазный белок, уровень которого увеличивается при воспалении, инфекционных и ревматических заболеваниях, некоторых злокачественных процессах, при заместительной терапии эстрогенами и беременности (в III триместре – ​в 2 раза). В норме печень в сутки секретирует 34 мг/кг массы тела А1АТ, а при развитии воспалительного и опухолевого процесса концентрация увеличивается в 2-5 раз. У пациентов с дефицитом данного белка не происходит его продуцирования. При разделении фракций общего белка в агарозном геле А1АТ находится во фракции альфа‑1-глобулинов.

Причиной поражения ткани легкого при дефиците А1АТ является дисбаланс в системе протеолиз-антипротеолиз. В этом случае происходит неконтролируемое повышение активности протеолитических ферментов, прежде всего нейтрофильной эластазы, в результате чего эластичные волокна и другие структуры экстрацеллюлярного матрикса нижних отделов дыхательных путей подвергаются медленной деструкции. Это приводит к потере эластичности легочной ткани, развитию обструктивных нарушений и эмфиземы.

Генетика А1АТ

А1АТ кодируется геном SERPINA1 (ингибитор сериновой пептидазы, clade A), находящимся в локусе ингибитора протеиназы (Pi) на длинном плече хромосомы 14q32.1 [13]. Локус Pi имеет длину 12,2 kb и состоит из четырех кодирующих (II-V), трех некодирующих (1A, 1B, 1C) экзонов и шести интронов. Экзоны II-V кодируют и содержат информацию о последовательности, которая определяет сам белок. Стартовый кодон (АТГ) служит для трансляции мРНК и сигнального пептида в экзоне II, а стоп-кодон (ТАА) находится в экзоне V. Область, кодирующая ингибиторный метионин реактивного центра (Met358), расположена в пределах V экзона. После транскрипции мРНК А1АТ транслируется на рибосоме, связанной с эндоплазматическим ретикулумом, и продуцирует препротеин с 418 аминокислотами. Сигнальный пептид, содержащий 24 аминокислотных остатка, удаляется во время секреции в эндоплазматический ретикулум, где происходит гликозилирование белка с высоким содержанием маннозных углеводов, и белок приобретает соответствующую конфигурацию шаровидного дерева. Полная сборка белка происходит внутри аппарата Гольджи, откуда происходит его секреция. Ген SERPINA1 является высокополиморфным.

Генетический полиморфизм А1АТ

Кодирующий ген А1АТ SERPINA1 является высокополиморфным с более чем 125 SNP (точечный нуклеотидный полиморфизм). Варианты белка A1AТ классифицируются по системе Pi (Protease inhibitor), и каждый вариант идентифицируется путем миграции при электрофорезе в агарозном геле. Эти различия в миграции связаны с изменениями заряда белка, который зависит от аминокислотного состава [14]. Изоэлектрическая фокусировка в узком диапазоне рН (4,2-4,9) позволила идентифицировать больше вариантов А1АТ по сравнению с электрофорезом в агарозном геле. Аллелям были присвоены символы в соответствии с электрофоретической подвижностью. При этом анодные варианты отмечены первыми, а катодные – ​последними буквами. Аллель Z (наиболее частый дефицитный вариант) двигается медленно и расположена близко к катоду (Z‑область). М‑аллель (нормальная аллель) продвигается к середине геля и попадает в М‑область [15].

Все варианты А1АТ подразделяются на четыре класса согласно уровню белка в сыворотке и его функциональной активности:

1. Нормальные. А1АТ вырабатывается в достаточном количестве и с нормальными свойствами.
2. Дефицитные. Вырабатывается недостаточное количество А1АТ. Причиной недостаточности ингибитора протеаз является его внутриклеточное накопление в гепатоцитах, где он синтезируется, или разрушение с высвобождением в кровоток минимальных его количеств.
3. Нулевые. А1АТ полностью отсутствует. Недостаточность обусловлена нарушениями транскрипции и синтезом неполноценного или нестабильного белка, разрушающегося еще до секреции.
4. Дисфункциональные. Уровень А1АТ не отличается от нормы, но белок не может выполнять свои функции, что обусловлено снижением или утратой антиэластазной активности.

Нормальные варианты А1АТ

Характеризуются достаточным уровнем в сыворотке и нормальной функциональной активностью для ингибирования нейтрофильной эластазы. Самым «распространенным» нормальным вариантом гена Pi является аллель М (более 95%). Среди европеоидов М1 (Val213) встречается наиболее часто, а М1 (Ala213), М2 и М3 – ​значительно реже. К «редким» нормальным вариантам с частотой встречаемости менее 1% относятся М4, B_Аlhambra, F, P_StAlbans и X_Christchurch. Редкие варианты названы по имени места рождения самого старого человека (в родословной) при лабораторном тестировании. Гомозиготные и гетерозиготные PiM характеризуются нормальным уровнем А1АТ в сыворотке (20-50 мкмоль/л) и нормальной функциональной активностью [16]. Необходимо отметить, что именно от М‑субтипов путем мутирования произошли все остальные нормальные и патологические варианты гена Pi.

Дефицитные варианты А1АТ

Низкое содержание А1АТ в сыворотке по сравнению с нормальными вариантами. Было идентифицировано несколько мутаций, связанных с А1АТ. Наиболее распространенными являются Z- и S‑аллели. К редким дефицитным вариантам А1АТ относятся M_Malton, M_{MineralSprings}, M_Nichinan, M_Procida, P_Lowell, S_Iiyama и др. Оценка возраста вариантов А1АТ, основанная на микросателлитной вариации, показывает, что дефицитная Z‑аллель появилась от 107 до 135 поколений назад, в эпоху неолита. Наибольшая частота вариации Z‑аллели наблюдается у европеоидов, редкая или полностью отсутствует – ​у азиатов и африканцев [17]. Аллель дефицита PiS имеет возраст от 279 до 479 поколений. Предполагается, что она могла возникнуть на Пиренейском полуострове [18].

Z‑аллель

Вариант Z представляет собой «классический» дефицитный вариант А1АТ, который имеет происхождение после точечной мутации от М1 (Ala213). Результатом мутации является замена нуклеотида GAG, кодирующего аминокислоту Glu342, на нуклеотид AAG, кодирующий Lys342 [19]. Z‑мутация приводит к изменению структуры белка [20].

Процесс полимеризации зависит от концентрации и температуры. Патология в посттрансляционной модификации белка вызывает накопление полимеров А1АТ в эндоплазматическом ретикулуме с резким снижением скорости секреции. Патологический белок накапливается в гепатоцитах и образует тела включения (агрегаты). А1АТ‑полимеры являются токсичными для гепатоцитов и могут вызвать разнообразные повреждения печени, начиная от неонатального гепатита до ювенильного цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы у взрослых. Вследствие аккумулирования полимера гепатоциты, гомозиготные PiZZ, секретируют только 10-15%, а гетерозиготный PiZM – ​50% от уровня нормальной циркуляции А1АТ. Кроме низкого уровня циркуляции, белок Z также менее эффективно ингибирует эластазу. Поэтому у людей с PiZZ количественные и качественные дефекты А1АТ приводят к ранней стадии ХОБЛ, включая эмфизему и хронический бронхит. Полимеры А1АТ были обнаружены в бронхоальвеолярной лаважной жидкости у гомозигот PiZ с эмфиземой. Это конформационное превращение может способствовать уменьшению уровней функционирования ингибитора протеиназы в легких и, как следствие, усугубить повреждение тканей легкого. Исследования J. Parmar и соавт. [21], A. Mulgrew и соавт. [22] показали, что ZA1AT, локально продуцируемый на эпителиальной поверхности легкого, полимеризуется, и полимеры А1АТ демонстрируют проапоптотические и провоспалительные эффекты. В этих исследованиях обнаружено, что ZА1АТ, в отличие от МА1АТ, является неэффективным антипротеазным ингибитором и может выступать сильным нейтрофильным хемоаттрактантом, что обусловливает появление постоянного источника воспаления в легких у людей с дефицитом А1АТ. Таким образом, полимеризация локального продуцирования ZА1АТ является фактором, способствующим воспалению легких у лиц с дефицитом А1АТ.

S‑аллель

В отличие от аллели Z, аллель S вызывает только умеренную недостаточность А1АТ в сыворотке. Генетическая последовательность S‑варианта образуется из М1 (Val213) в результате мутации, которая вызывает замещение нуклеотида GAA, кодирующего аминокислоту Glu264 на нуклеотид GTA, кодирующий Val264. Одиночная мутация варианта S приводит к спонтанному формированию полимера, но медленнее, чем вариант Z, и не влияет на способность ингибировать эластазу нейтрофилов [23]. Более медленная полимеризация приводит к уменьшению S‑вариантов в печени, поэтому уровни в сыворотке составляют 60% от нормальной М‑аллели. Так, носители аллели S (PiSS, PiSZ и PiMS) имеют 52, 32 и 75% соответственно от нормального уровня. Кроме того, ZA1AT образуют гетерополимеры с SA1AT, которые объясняют случаи цирроза печени у PiSZ‑пациентов.

Нулевые варианты А1АТ

Характеризуются модификацией важной части гена с неопределяемой мРНК. Хотя они являются чрезвычайно редкими, встречаются во всех популяциях. Частота встречаемости среди европеоидов составляет менее 0,1%. Варианты нулевых аллелей обозначаются как Q0, а не Pi. Мутации Null не приводят к секреции белка или образованию полимеров. У пациентов с Null-мутацией отмечается значительное снижение функции легких по сравнению с пациентами, имеющими PiSZ и PiZZ, и они имеют особенно высокий риск развития эмфиземы [24]. Раннее выявление нулевых носителей важно для профилактических и терапевтических вмешательств. Аллель PiNull_Bellingham отличается от нормального гена М1 (Val213) мутацией в экзоне II, где кодон для Lys217 (AAG) изменяется на стоп-кодон (TAG). У гомозиготных индивидуумов с PiNull_Bellingham отмечается полное отсутствие А1АТ и эмфизема развивается намного раньше, чем у более распространенной формы PiZZ. Мутация Null_{Isola di Procida} вызвана полным удалением экзонов II-V гена SERPINA1 [25].

Дисфункциональные варианты А1АТ

Белок синтезируется в нормальных количествах, но имеет изменения в функционировании. Аллель Pi_Pittsburgh является мутацией, которая возникает на активном сайте А1АТ и ответственна за изменение функционирования продукта гена. А1АТ становится мощным ингибитором тромбина и фактора XI, а не эластазы, что приводит к развитию кровотечения.

Показаниями для исследования уровня А1АТ в сыворотке крови являются:

• ХОБЛ среди пациентов молодого возраста (курящие и некурящие);
• раннее появление эмфиземы легких;
• бронхоэктатическая болезнь;
• бронхиальная астма, плохо отвечающая на лечение;
• частые обострения бронхита, пневмонии;
• быстрое прогрессивное снижение функции внешнего дыхания;
• хронический кашель и одышка;
• семейный анамнез заболеваний легких и печени;
• заболевание печени неясного генеза;
• наследственный дефицит А1АТ;
• панникулит/васкулит.

В случае подозрения на дефицит А1АТ при наличии одного или нескольких из перечисленных критериев предлагается использовать алгоритм диагностики, представленный на рисунке 1 [26].

Референтные значения А1АТ в сыворотке

Нормальное содержание А1АТ в сыворотке составляет 0,9-2,0 г/л, или 18,4 (17-37) мкмоль/л, или 100 (90-200) мг/дл. Дефицитом А1АТ считается уровень в сыворотке крови менее 0,8 г/л (15 мкмоль/л, или 80 мг/дл).

Наиболее часто встречающиеся фенотипы и соответствующие уровни А1АТ в сыворотке представлены в таблице 1.

Для выявления групп риска среди пациентов с первичной эмфиземой легких считается целесообразным проведение скрининга на дефицит А1АТ с последующим его генотипированием (табл. 2).

Лабораторные методы оценки дефицита А1АТ

Всем пациентам с подозрением на наследственный дефицит А1АТ рекомендуется измерение уровня данного белка в сыворотке крови. Для количественного определения концентрации А1АТ в сыворотке крови применяются нефелометрические и турбидиметрические тесты. Интерпретируя результаты, следует учитывать, что при инфекционных и воспалительных реакциях, опухолях, стрессе, шоке, беременности, приеме эстрогеносодержащих препаратов уровень А1АТ в крови повышается. Исследование рекомендуется проводить вне периода обострения, связанного с дефицитом А1АТ. К качественным методам определения А1АТ относят генотипирование с помощью молекулярно-биологических технологий и молекулярное фенотипирование. Для анализа фенотипов А1АТ широкое распространение получил метод изоэлектрофокусирования, который позволяет определять более 100 различных фенотипических вариантов А1АТ, не прибегая к дорогостоящему секвенированию полной последовательности гена Pi (рис. 2) [28].

В клинической практике недостаточность А1АТ у 95% пациентов ассоциируется с аллелями PiZ и Pi S.

Выводы

1. Дефицит А1АТ является недооцененным заболеванием и относится к редким ввиду неактуальности проведения скрининга в Украине. Главной причиной этого является ограниченность знаний врачей-клиницистов о данном заболевании респираторной системы.
2. Часто проходит длительный период времени от начала заболевания до постановки диагноза (5-7 лет).
3. В большинстве случаев диагноз недостаточности А1АТ основывается только на определении концентрации данного белка в сыворотке без генетической верификации.
4. Данное заболевание часто не распознают или диагностируют неправильно (особенно дефицит PiZZ).
5. Тяжесть заболевания определяется не только вариантом мутации, но и внешними факторами окружающей среды, что может провоцировать и отягощать проявление дефицита.
6. Для лечения данного заболевания используется А1АТ‑замещающая терапия.

Список литературы находится в редакции.

Медична газета «Здоров’я України 21 сторіччя» № 24 (469), грудень 2019 р.