Вироблення бактеріоцину пробіотичним штамом LaKS400

22.07.2020

Стаття у форматі PDF

Мета цього дослідження – вперше ідентифікувати та охарактеризувати бактеріоцин, що природним шляхом виробляється штамом LaKS400 (пробіотичний штам, який міститься у препараті Гінофлор® виробництва компанії Medinova AG, Швейцарія), та вивчити його протимікробну активність щодо відповідних урогенітальних патогенів.

За результатами дослідження вперше було зареєстровано новий бактеріоцин, який виробляється штамом LaKS400 (пробіотичний штам, який міститься у препараті Гінофлор® [Gynoflor®]).

Виявлений бактеріоцин є білковою протимікробною сполукою з  молекулярною масою 7,5 кДа та протимікробною активністю щодо вагінальних патогенних мікроорганізмів, зокрема Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa (патогенів, що найчастіше спричиняють вагінальні інфекції), та індикаторного штаму Lactobacillus delbrueckii ATCC9649.

Термін «пробіотик» походить від грецьких слів pro і bios – ​«для життя» й означає «живі мікроорганізми, які при застосуванні у відповідній кількості чинять сприятливий вплив на організм людини» (комітет Продовольчої і сільськогосподарської організації ООН, 2006). Протягом останніх трьох десятиліть велика увага приділялася застосуванню пробіотиків для лікування та профілактики вагінальних захворювань (Barrons and Tassone, 2008; Coudeyras et al., 2009; Homayouni et al., 2014). Баланс між різними мікроорганізмами, з яких складається люд­ська вагінальна мікрофлора, є важливим для підтримання її гомео­стазу, що безпосередньо впливає на стан здоров’я жінки (Ravel et al., 2011; Gajer et al., 2012). Серед домінантних мікроорганізмів бактерії роду Lactobacillus становлять щонайменше 70% (107‑108 КУО [колоніє­утворюючих одиниць]/г вагінальної рідини) бактерій, виявлених у репродуктивній системі здорових жінок премено­паузального віку (Zhou et al., 2004; Strus et al., 2005; Anukam et al., 2006; Ravel et al., 2011).

Найпоширенішими видами бактерій Lactobacillus у піхві жінки є L. crispatus, L. jensenii, L. gasseri та L. iners (Pavlova et al., 2002; Vasquez et al., 2002; Zhou et al., 2010). У вагінальному епітелії Lactobacillus індукують пробіоз у два етапи: (1) колонізація поверхні епітелію, конкуренція за ділянки зв’язування та стимуляція коагрегації патогенів (конкурентне витіснення) (Zarate and Nader-Macias, 2006; Coudeyras et al., 2009; Martin et al., 2012); та (2) вироб­лення протимікробних метаболічних речовин, здатних конт­ролювати збережену вагінальну мікрофлору (знищення, інгі­бування мікробів) (Kaewsrichan et al., 2006; Voravuthikunchai et al., 2006; Heng-Yi et al., 2008). Серед різних метаболітів, які виробляються бактеріями Lactobacillus, органічні кислоти (переважно молочна) та перекис водню відповідають за інгібуючу дію щодо широкого спектра мікробів (Tomas et al., 2003; O’Hanlon et al., 2013).

Крім того, повідомлялося про здатність деяких бактерій до вироблення більш специфічних протимікробних білків (бактеріоцинів) (Aroutcheva et al., 2001; Pingitore et al., 2009; Turovskiy et al., 2009). Бактеріоцини – ​це речовини білкової природи, які проявляють бактерицидну або бактеріостатичну активність щодо бактерій близько­споріднених видів (вузький спектр) або всього роду (широкий спектр) (Klaenhammer, 1993; Cotter et al., 2005). Грампозитивні бактерії, зокрема молочнокислі (лактобацили, лактококи та педіококи), виробляють протимікробні пептиди та білки в рибосомах, наприклад лактацин B із Lactobacillus acidophilus (Barefoot and Klaenhammer, 1983; Muriana and Klaenhammer, 1991), плантарицин 423 з Lactobacillus plantarum (Van Reenen et al., 1998), педіоцин ST18 із Pediococcus pentosaceus (Todorov and Dicks, 2005), нізин Q з Lactococcus lactis (Zendo et al., 2003) та деякі інші з інших бактерій (Netz et al., 2002; Srionnual et al., 2007). Завдяки вищезазначеним характеристикам рід Lactobacillus був запропонований як вагінальний пробіо­тик і застосовувався для відновлення балансу вагінального середовища та запобігання росту патогенів у піхві (Kaewsrichan et al., 2006; Zarate and Nader-Macias, 2006). Безпечне застосування бактерій роду Lactobacillus як вагінального пробіотика для людини почалося з 1915 року (Newman, 1915). В описаному дослідженні in vitro визначали, чи виробляє Lactobacillus acidophilus KS400 (LaKS400, Гінофлор® виробництва компанії Medinova AG, Швейцарія) бактеріоцин, й оцінювали його протимікробну активність.

Матеріали та методи

Штами мікроорганізмів

Бактеріальні та грибкові штами, застосовані в дослідженні, зокрема досліджуваний штам (LaKS400), індикаторний штам біоактивності (Lactobacillus delbrueckii ATCC9649) та урогенітальні патогени, відібрані для оцінки протимікробної активності білка, наведено в табл. 1. Бактеріальні та грибкові штами суспендували в належному середовищі з додаванням 25% гліцерину (VWR, Іспа­нія) і зберігали замороженими при температурі -80 °C до моменту використання.

Якщо було необхідне агарове середовище (наприклад, для підтримання росту мікроорганізмів), до рідкого середовища додавали бактеріологічний агар (VWR, Іспанія) у кінцевій концентрації 20 г/л. М’який агар Мана, Рогози та Шарпа (MRS) готували із застосуванням бактеріо­логічного агару в концентрації 7,5 г/л.

Виявлення бактеріоцину

LaKS400 культивували в 10 мл бульйону MRS (VWR, Іспанія) з pH=6,5 протягом 24 год при температурі 37 °C у присутності 10% CO2. Після інкубації клітинну культуру нагрівали при 70 °C протягом 30 хв, щоб забезпечити пригнічення активності протеази, після чого охолоджували при кімнатній температурі та центрифугували (зі швидкістю 4500 об/хв протягом 15 хв при 4 °C) у настільній центрифузі (модель Heraeus megafuge 8R компанії Thermofisher Scientific, США). Щоб нейтралізувати проти­мікробну дію органічних кислот, pH надосадової ­рідини доводили до 6,5 за допомогою 10 M розчину NaOH. Інгібуючу дію перекису водню нейтралізували шляхом додавання каталази з бичачої печінки (Sigma-Aldrich, США) у концентрації 5 мг/мл, після чого фільт­рували розчин крізь целюлозно-ацетатний фільтр із розміром пор 0,2 мкм (Fisher-Scientific, Велика Британія).

Виявлення бактеріоцину виконували модифікованим методом дифузії штамів-антагоністів, описаним Tagg and McGiven (1971). В агарових пластинах робили лунки діа­метром 4 мм і наповнювали безклітинною культурою надосадової рідини в об’ємі 100 мкл. Фосфатно-сольовий буферний розчин (PBS) використовували як негативний контроль. Пластини витримували при кімнатній температурі протягом 3 год, щоб відбулася дифузія бактеріоцину, після чого інкубували при 37 °C у присутності 10% CO2 протягом 24‑48 год. Активність бактеріоцину визначали шляхом макроскопічного спостереження чіткої зони інгібування на агарі.

Вироблення бактеріоцину

Щоб дослідити кінетику вироблення бактеріоцину, 500 мл бульйону MRS із pH=6,5 інокулювали штамом LaKS400 (1% об./об.) та інкубували при температурі 37 °C у присутності газоподібного азоту без перемішування. Протягом ферментації щогодини визначали скупченість бактеріальних клітин і pH культурального середовища. Кожні 2 год оцінювали протимікробну активність щодо індикаторного штаму (Lactobacillus delbrueckii ATCC9649), як описано вище.

Для вироблення бактеріоцину 20-годинну культуру (10 мл) LaKS400 висіювали (1% об./об.) в 1 л бульйону MRS. Періодичну ферментацію виконували протягом 24 год при температурі 37 °C, без перемішування, у присутності азоту. Ця процедура забезпечує переривання росту бактерій перед стаціонарною фазою. Таким чином, це запобігає розщепленню бактеріоцину протеазами, що вивільняються в позаклітинне середовище.

Приготування екстрактів бактеріоцину

Екстракти бактеріоцину готували згідно з методикою, описаною Yang et al. (1992), з деякими модифікаціями.

Електрофорез

Оскільки одновимірний електрофорез білків (розділення в одному вимірі) дає змогу розділити біомолекули згідно з розміром та структурою, екстракт бактеріоцину, який виявляв біоактивність проти індикаторного штаму, піддавали електрофорезу у тріцин-поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (Tricine-SDS-PAGE) на апараті Bio-Rad Mini Protean 3 Cell (Bio-Rad, США).
Протимікробна активність

Протимікробну активність бактеріоцину оцінювали методом мікророзведень, описаним в інших публікаціях (Standards, 2006; Rex et al., 2008).

Результати

Виявлення бактеріоцину

Протимікробна активність бактеріоцину, виробленого штамом LaKS400 та отриманого із профільтрованого культурального середовища після нейтралізації органічних кислот і перекису водню, показала чітку зону інгібування в агарі порівняно з негативним контролем (PBS) (інгібування не спостерігалось), при цьому Lactobacillus delbrueckii ATCC9649 застосовувався як індикаторний організм (рис. 1).

Рис. 1. Протимікробна активність бактеріоцину пробіотичного штаму LaKS400 щодо штаму Lactobacillus delbrueckii ATCC9649. Тестування екстракту культури LaKS400 методом дифузії в агарі (Tagg and McGiven, 1971);
S1 – культуральне середовище з середовища LaKS400;
PBS 1X – негативний контроль, що відповідає х 1 фосфатно-сольового буферного розчину

 

Вироблення бактеріоцину та кінетика метаболітів

Органічні кислоти, які виробляються бактеріями роду Lactobacillus (внаслідок ферментації вуглеводів), індукують зменшення pH середовища. Метод періодичної ферментації підтверджує зменшення pH, яке відбувається внаслідок акумуляції органічних кислот в позаклітинному середовищі (рис. 2, синя лінія). Після 36 год ферментації LaKS400 значення pH становило 4,3. У цьому дослідженні протимікробну дію органічних кислот нейтралізували шляхом додавання лужного розчину, щоб усунути їх можливий вплив при оцінюванні проти­мікробної активності бактеріоцину. Крім того, ми також враховували, що протягом періодичної ферментації, яка є складовою частиною процедури, може вироблятися певна кількість перекису водню, тому ми здійснили його каталізацію шляхом додавання каталази у середовище після завершення ферментації.

Рис. 2. a – Періодична ферментація штаму LaKS400 в бульйоні MRS із неконтрольованим pH (початкове значення – 6,5) при температурі 37 °C. Ліва вісь: коефіцієнт поглинання (Abs) при 600 нм; основна права вісь: значення pH; додаткова права вісь: відносна активність бактеріоцину (%); нижня вісь: час (год). Позначки: (•) оптична щільність при 600 нм; (•) зміни в значеннях pH; (оранжеві стовпчики) вироблення бактеріоцину.
b – Протимікробна активність штаму LaKS400 протягом ферментації; визначали активність проти
Lactobacillus delbrueckii ATCC9649, пластини інкубували при температурі 37 °C; 10% CO2

Отже, відносну активність бактеріоцину визначали у зразку, який виявив найвищу біоактивність (через 30 год). Профілі періодичної ферментації LaKS400 вказували на те, що вироблення бактеріоцину було більш вираженим і явно підвищеним протягом експоненційної фази росту, після чого знижувалося в фазі стаціонарного росту, як показано на рис. 2а (оранжеві стовпчики).

Після 32 год ферментації спостерігалася втрата проти­мікробної активності бактеріоцину (рис. 2), про що свідчило зменшення ореолу інгібування.

Молекулярна маса бактеріоцину

Розділення білків та оцінку біоактивності здійснювали із застосуванням індикаторного штаму (Lactobacillus delbrueckii ATCC9649) безпосередньо під час гель-­­електро­форезу (рис. 2b), щоб ідентифікувати активний білок. При екстракції білків шляхом Tricine-SDS-PAGE гель-­електрофорезу спостерігалася одинична зона пригнічення росту в місці, де на шар гелю було нанесено індикаторний штам (рис. 3). Додавання β-меркаптоетанолу не впливало на протимікробну активність бактеріоцину (+β на рис. 3).

Білок, що виявляв протимікробну активність при гель-електрофорезі, відповідав смузі з розрахованою молекулярною масою приблизно 7,5 кДа, з урахуванням того, що біоактивність і смуга бактеріоцину відзначалися на рівні нижче маркерного білка з масою 11 кД.

Рис. 3. Пряме виявлення протимікробної активності бактеріоцину LaKS400 (A) Tricine-SDS-PAGE гель-електрофорезом
здійснювалося за допомогою системи ChemiDoc™ MP (Biorad) із застосуванням режиму без фарбування для білкових гелів:
(MW) молекулярні маси стандартних білків (NZYTECH, Португалія); -β/+β – відсутність та присутність β-меркаптоетанолу
(B) Зона пригнічення росту відповідає положенню протимікробного білка (бактеріоцину)

Активність бактеріоцину проти патогенних штамів

Екстракт бактеріоцину LaKS400 тестували проти індикаторного штаму, патогенних бактерій (включно з колекційними зразками та клінічними ізолятами) та штаму Candida albicans ATCC10231, як показано в табл. 2. Було встановлено, що екстракт бактеріоцину пригнічує ріст індикаторного штаму Lactobacillus delbrueckii ATCC9649, а також штамів Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae та Pseudomonas aeruginosa.

Коментар

Метою дослідження було оцінити здатність LaKS400 виробляти бактеріоцин із протимікробною активністю щодо урогенітальних патогенів, з виявленням механізму дії, про який не повідомлялося в попередніх дослідженнях цього штаму in vitro (Unlu and Donders, 2011).
Вироблення та виявлення бактеріоцину здійснювалося in vitro та супроводжувалося утворенням інших бакте­ріальних метаболітів (таких, як молочна кислота та перекис водню), які раніше були описані для цього штаму. Таким чином, щоб переконатися в тому, що оцінювана біоактивність екстракту білка не пов’язана з цими мета­болітами, їхній вплив нейтралізували. Отже, результати експерименту дають підстави припустити, що штам LaKS400 в позаклітинному культуральному середовищі виробляє та секретує бактеріоцин, який є білковою протимікробною сполукою. Вироблення бактеріоцину відбувається протягом експоненційної фази та досягає максимуму у стаціонарній фазі кривої росту штаму (через 24‑30 год після початку ферментації), як зазначалося також щодо інших бактеріоцинів (De Vuyst and Vandamme, 1992; De Vuyst et al., 1996; Zamfir et al., 2000).

Проте після 32 год ферментації спостерігалася втрата протимікробної активності бактеріоцину. Ця зміна біоактивності може бути пов’язана з агрегацією білків або протеолітичною деградацією бактеріоцину (Law and Kolstad, 1983).

На підставі наведених результатів ми дійшли висновку, що LaKS400 виробляє бактеріоцин із очікуваним розміром 7,5 кДа. Молекулярна маса знаходиться у межах діапазону мас, які найчастіше зустрічаються у бактеріоцинів із бактерій роду Lactobacillus (De Vuyst and Vandamme, 1994). Розмір виявлених бактеріоцинів, що виробляються бактеріями Lactobacillus acidophilus, становить від 2,5 до 100 кДа (Barefoot and Klaenhammer, 1983; Muriana and Klaenhammer, 1991; Zamfir et al., 1999). Крім того, не спостерігалося зниження протимікробної активності екстракту бактеріоцину у присутності β-меркаптоетанолу. Результат свідчить про те, що активність не пов’язана з наявністю дисульфідних містків. Це характерно для бактеріоцинів II класу, оскільки вони містять у своєму складі щонайменше два цистеїни, які утворюють хімічний зв’язок (Ennahar et al., 2000). Дисульфідні містки виявлені в деяких видах бактерій роду Lactobacillus, зокрема L. curvatus (Tichaczek et al., 1993), L. plantarum (Ennahar et al., 1996), L. sake (Schillinger and Lucke, 1989) та ін. Можливо, будуть проведені подальші дослідження, які включають клонування, експресію та виділення з переносника та мікроорганізму-хазяїна з метою встановлення його функції.

Паралельно ми провели тести для оцінки протимікробної біоактивності екстракту бактеріоцину щодо деяких урогенітальних патогенів. Було встановлено, що екс­тракт бактеріоцину інгібує ріст індикаторного штаму, грампозитивних бактерій (Gardnerella vaginalis і Streptococcus agalactiae) та грамнегативних бактерій Pseudomonas aeruginosa. Проте не спостерігалося протимікробного ефекту щодо застосовуваних штамів Escherichia coli, Staphylococcus aureus і Candida albicans.

Такий результат був досить очікуваним, оскільки бактеріоцини діють переважно проти бактерій близько­споріднених видів, тоді як протигрибкова активність лактобацил пов’язана з іншими протимікробними ефектами, наприклад із конкуренцією за ділянки зв’язування. Аналогічні результати спостерігалися ще в одному опублікованому досліджені (Mitra et al., 2005), хоча зазначалося, що бактеріоцини, які виробляються молочнокислими бактеріями (зокрема, Lactobacillus), активні переважно проти грампозитивних бактерій (Jack et al., 1995; Heng et al., 2007). Крім того, було опубліковано кілька досліджень щодо бактеріоцинів, які вироб­ляються бактеріями Lactobacillus acidophilus. Наприклад, Lactobacillus acidophilus DSM20079 виробляв протимікробний бактеріоцин (ацидоцин D20079) з молекулярною масою близько 6,6 кДа, який проявляв інгібуючу активність щодо Lactobacillus, зокрема Lactobacillus lactis DSM20076 (підвид Lactobacillus delbrueckii), Lactobacillus bulgaricus DSM20080 та Lactobacillus sakei NCDO2714, але не спостерігалося помітної активності проти інших патогенів (Deraz et al., 2005). Інші дослідники зазначали, що активні бактеріоцини, які виробляються бактерія­ми Lactobacillus acidophilus, являють собою малі пептиди з різними фізико-хімічними властивостями. Що стосується Lactobacillus acidophilus JCM1132, то було описано термостійкий двокомпонентний бактеріоцин (J1132), який виявляє інгі­буючу активність вузького спектра проти непатогенних штамів (Tahara et al., 1996), а для Lactobacillus acidophilus ATCC4356 було ідентифіковано бактеріоцин із молекулярною масою 3,1 кДа, активний проти патогенних штамів (Han et al., 2002).

Висновки

Ці результати підтверджують пробіотичну ефективність LaKS400 (пробіотичний штам, який міститься у препараті Гінофлор®) у разі його застосування при вагінальних або інших патологіях. Фактично у цьому дослідженні вперше було зареєстровано новий ­бактеріоцин, який виробляється штамом LaKS400, з розрахунковим розміром 7,5 кДа та протимікробною активністю щодо вагінальних патогенних мікроорганізмів, зокрема Gardnerella vaginalis і Streptococcus agalactiae, двох патогенів, що найчастіше спричиняють вагінальні інфекції.
Отримані результати підтверджують новий механізм дії цього пробіотичного штаму й обґрунтовують його застосування у клінічній практиці для лікування та профілактики вагінальних інфекцій. Можуть бути проведені подальші дослідження з метою вдосконалення вироблення, виділення, очищення бактеріоцину та вивчення можливого механізму його дії.

За матеріалами: C. Gaspar, G.G. Donders, R. Palmeira-de-Oliveira et al. Bacteriocin production of the probiotic Lactobacillus acidophilus KS400. AMB Express. 2018; 8: 153.

Тематичний номер «Акушерство, Гінекологія, Репродуктологія» № 2 (38) 2020 р.

СТАТТІ ЗА ТЕМОЮ Акушерство/гінекологія

28.07.2020 Акушерство/гінекологія Можливості застосування міо-інозитолу в репродуктивній медицині

Фахівці у сфері репродуктології відмічають наступні сучасні тенденції: вагітність настає в більш пізньому віці, зростає кількість жінок репродуктивного віку з надмірною масою тіла, інсулінорезистентністю, тромбофілією, які потребують проведення спеціальної прегравідарної підготовки й, за необхідності, процедури екстракорпорального запліднення. 7 квітня в режимі онлайн-конференції відбувся виступ професора кафедри акушерства та гінекології № 1 Одеського національного медичного університету, доктора медичних наук Олени Миколаївни Носенко, під час якого вона ознайомила слухачів із сучасними можливостями використання міо-інозитолу в репродуктивній медицині. Інозитол являє собою циклічний поліол, вітаміноподібну речовину, яка має 9 стереоізомерів. Добова потреба організму в інозитолі складає від 4 до 8 г. 75% добової потреби інозитолу виробляється ендогенно. Із продуктами харчування людина отримує 1‑2 г цієї речовини щоденно. ...

28.07.2020 Акушерство/гінекологія Легкі форми гіперандрогенії у жінок: можливі ризики для здоров’я та оптимальні підходи до лікування

Гіперандрогенія є поширеним ендокринним розладом у жінок репродуктивного віку та ключовим проявом синдрому полікістозу яєчників. Актуальність проблеми надлишку андрогенів пов’язана не лише з негативним впливом на жіночу фертильність, а і з високим ризиком розвитку інсулінорезистентності, цукрового діабету 2-го типу, дисліпідемії та серцево-судинних захворювань. Вчасна корекція ендокринних та метаболічних порушень, зокрема комплексами D-кіро-інозитолу, має вирішальне значення для ефективного лікування та профілактики зазначених ускладнень у пацієнток даного профілю. ...

25.07.2020 Акушерство/гінекологія Вплив ендокринних порушень на реалізацію репродуктивної функції жінки: яка допомога можлива?

Пристосовуючись до сучасного темпу життя, репродуктивна медицина дедалі більше почала зосереджуватися на питаннях впливу стресових факторів і метаболічних змін на жіноче здоров’я. Адже саме стрес, порушення нутритивного статусу й гормонального фону призводять до розвитку ендокринних захворювань, репродуктивних розладів та проліферативних процесів. Саме цій проблематиці була присвячена ІІ Міжнародна школа з гінекологічної та репродуктивної ендокринології (USGRE), що відбулася 3-4 квітня в онлайн-форматі...

25.07.2020 Акушерство/гінекологія Онкологія та гематологія Рак і вагітність

Рак у період вагітності хоча і є рідкісним випадком, та, як показали деякі епідеміологічні дослідження, його частота в останні роки зростає. Зокрема у данському реєстрі зафіксовано збільшення частки раку, пов’язаного з вагітністю, з 5,4 (n=572) до 8,3% (n=1052) протягом 30 років. Найпоширенішими пухлинами є меланома, рак шийки матки та грудної залози [1]. Підвищення захворюваності на рак у період вагітності не можна пояснити лише збільшенням материнського віку....