Устойчивость спор и вегетативных клеток Bacillus clausii к пробам, имитирующим транзит по желудочно-кишечному тракту

Bacillus clausii – грамположительная, аэробная, эндоспорообразующая, факультативная алкалофильная палочковидная бактерия. B. clausii продуцирует каталазу и оксидазу, гидролизует желатин и крахмал, восстанавливает нитраты, растет при температуре от 30 до 50° C и в присутствии NaCl (до 10%). Организмы этого вида не гидролизуют пуллулан и Твин. Совокупное содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет около 43 моль% (Nielsen et al., 1995).

Штаммы Bacillus clausii часто обнаруживаются как составляющие микрофлоры почвы, а некоторые их свойства могут использоваться в важных областях применения промышленных и биотехнологических отраслей, а именно в производстве щелочной протеазы и ксиланазы (Nielsen et al., 1995; Denizci et al., 2004; Joo et al., 2003; Kumar et al., 2004). Кроме того, B. clausii наряду с прочими спорообразующими бациллами является важным для человека пробиотиком (Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus coagulans, Bacillus cereus var. vietnami) (Sanders et al., 2003). В рамках последнего таксономического пересмотра, основанного на молекулярном анализе (Green et al., 1999; Hoa et al., 2000; Senesi et al., 2001), в состав вида B. clausii было включено четыре устойчивых к действию антибиотиков штамма (прежде классифицировались как B. subtilis), которые входят в состав пробиотического препарата Энтерожермина, применяемого для пероральной профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Энтерожермина применялась в Италии в виде споровой суспензии около 40 лет, а в настоящее время этот препарат доступен и в других странах.
На протяжении долгих лет считалось, что споры вида Bacillus не в состоянии размножаться в такой среде с низким окислительно-восстановительным потенциалом, как ЖКТ. Однако недавно были продемонстрированы адаптация к ограниченному содержанию кислорода и анаэробный рост B. subtilis (Nakano, Zuber, 1988; Marino et al., 2000). Размножение бацилл спорами в тонком кишечнике позднее наблюдалось в модели с крысами при использовании подходов формирования культуры и молекул (Hoa et al., 2001; Casula, Cutting, 2002; Duc et al., 2003). По данным литературы пробиотическое действие Энтерожермины эффективно в профилактике и лечении острой диареи и кишечных инфекций (Mazza, 1994), минимизации негативных эффектов антибиотикотерапии со стороны ЖКТ (Mazza et al., 1992; Nista et al., 2004), иммуномодулирующему действию путем стимуляции синтеза иммуноглобулинов (IgA, IgG) и регуляции цитокинов у человека (Muscettola et al., 1992; Duc et al., 2003; Ciprandi et al., 2004). Экспериментальные исследования показывают, что штамм O/C обладает противомикробным действием в отношении грамположительных видов (например, Staphylococcus aureus и Clostridium difficile) и способен как стимулировать рост CD4+ Т-клеток, так и активировать популяции лейкоцитов в селезенке и брюшине экспериментальных животных (Urdaci et al., 2004). Кроме этого способность B. clausii ингибировать генотоксическое действие 4-нитрохинолин-1-оксида (мощного канцерогена) была показана в лабораторных условиях в ходе краткосрочного исследования бактерий (Caldini et al., 2002).
Данные как экспериментальных, так и клинических исследований однозначно демонстрируют пробиотическое действие B. clausii. Тем не менее, некоторые механизмы, относящиеся к гибели этих бактерий в желудочно-кишечном тракте, требуют дальнейшего изучения.
Способность вегетативных клеток выживать в желудочно-кишечном тракте после прохождения через желудок, представляет собой важную область исследования. Желчные кислоты оказывают мощное противомикробное действие, поэтому флора ЖКТ выработала механизмы сопротивления действию желчи (Gunn, 2000). По сравнению с грамотрицательными грамположительные бактерии, как правило, менее устойчивы к желчным кислотам, выделяющимся в двенадцатиперстную кишку, таким как N-ацильные соединения, конъюгированные с глицином или таурином (Ahn et al., 2003). Во многих исследованиях получены данные о способности лактобацилл и бифидобактерий переносить кислотность желудка и действие желчных солей, присутствующих в ЖКТ, с вариабельностью между штаммами (Charteris et al., 1998; Prasad et al., 1998; Haller et al., 2001). Стало известно об устойчивости спор Bacillus к кислотам, а также было подтверждено значение кислотности для активирования размножения спорами (Ciffo et al., 1987; Mazza, 1994; Faille et al., 2002). Также имеются данные об устойчивости спорообразующих пробиотиков к действию желчи (Hyronimus et al., 2000; Spinosa et al., 2000), а общий коэффициент выживаемости спор Энтерожермины был подтвержден при использовании искусственного желудочного сока; меньший коэффициент выживаемости (77-83%) наблюдался при воздействии на них искусственным кишечным соком на протяжении 3 ч (Duc et al., 2004). Несмотря на это, убедительные доказательства устойчивости вегетативных клеток к действию кислоты и желчи пока не получены.
Целью настоящего исследования было изучить устойчивость четырех пробиотических штаммов B. clausii к действию кислоты и желчи при изучении влияния конъюгированных и свободных желчных солей (CBS-FBS) и сравнить их поведение с поведением совокупности штаммов того же вида и контрольных штаммов B. subtilis. Указанные бактерии также анализировали с целью определения таких свойств, как алкалофильный рост.

Материалы и методы
Штаммы бактерий
Четыре пробиотических штамма B. clausii (O/C, N/R, SIN и T), а также соответствующая смешанная форма (MIX), представляющая собой препарат Энтерожермина, были получены в виде суспензий спор от компании (дата приготовления: 21 января 2002; в MIX содержатся четыре штамма в тех же пропорциях). Контрольный набор штаммов был предоставлен в лиофилизированной форме компаниями DSM (Германия) и ATCC (США). Эти штаммы были такие: B. clausii DSM 8716^Т, DSM 2512, DSM 9783; B. subtilis ATCC 6051^Т, ATCC 33677. Споры
и лиофилизированные формы оживляли в питательном бульоне (ПБ) Лурия (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 5 г/л) и инкубировали при температуре 37° C на протяжении 24-48 ч.

Питательные среды
Кинетику роста исследовали в питательном бульоне (ПБ), подсчет жизнеспособных спор проводили на питательном агаре (ПА). Среды были предоставлены компанией Oxoid (Англия). Споры набора штаммов были получены на агаре из почвенной вытяжки (пептон 5 г, говяжья вытяжка 3 г, бактериальный агар 15 г, водопроводная вода 750 мл, автоклавированная почвенная вытяжка 250 мл) (Gordon et al., 1973).

Желчные соли
В исследовании использовали экстракт бычьей желчи L55 (Oxoid), содержащий конъюгированные гликолат и таурохолат натрия (CBS); бычью желчь B-8381 (Sigma-Aldrich, США), содержащую CBS-FBS; желчные соли B-8756 (Sigma-Aldrich), содержащие свободные соли холевой кислоты и натрия дезоксихолат (FBS) в соотношении 1:1. Желчные соли растворяли в дистиллированной воде, фильтровали через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм (Sartorius, Германия) и добавляли в стерильную среду.

Процедура
Споры и вегетативные клетки изучали на предмет их устойчивости к экспериментальному воздействию. В ходе различных проб бактерии добавляли в жидкую среду или физиологический раствор (в зависимости от пробы) и инкубировали на протяжении 24-48 ч при температуре 37° C наряду с контрольными штаммами. Кинетику роста изучали при помощи автоматического биофотометра (Bonet-Maury, Франция) при длине волны 620 нм на протяжении 24 ч. Начальную и конечную жизнеспособность клеток анализировали посредством высевания соответствующих разведений на твердых средах с последующим инкубированием при температуре 37° C и pH 8,0 (если не указано иное).

Устойчивость к действию щелочей
Кинетику роста изучали в ПБ при pH 8,0 и 10,0. Значения pH получали при помощи натрия сесквикарбоната 0,1 моль/л (Fritze et al., 1990).

Устойчивость к действию кислот
Выживаемость спор и вегетативных клеток оценивали после 1-2-часового воздействия кислотой в физиологическом растворе. Значения pH 2,0; 4,0 и 6,0 получали с помощью HCl 0,2 моль/л, цитратного буфера 0,2 моль/л и фосфатного буфера 0,2 моль/л соответственно (Ciffo et al., 1987; Gotcheva et al., 2002). Жизнеспособность определяли путем высевания на твердых средах.

Устойчивость к действию желчи
Устойчивость к действию желчи определяли путем инкубации вегетативных клеток в ПБ, содержащем CBS или смесь CBS-FBS с конечными концентрациями в 0,5 и 1% объемного веса. Кинетику роста и жизнеспособность оценивали на протяжении 24 ч. Уровни желчи были выше обычно выбираемых уровней для исследования устойчивости пробиотиков (Charteris et al., 1998; Prasad et al., 1998; Hyronimus et al., 2000). Значения pH были приведены до 8,0 в соответствии с экспериментальными протоколами, разработанными для лактобацилл (Charteris et al., 1998; Haller et al., 2001) и пропионовых бактерий (Huang, Adams, 2004). Фактически pH желчи и поджелудочного сока, выделяемого в кишечник, составляет примерно 8,0.
Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) определяли в пробирках с ПБ, содержащим CBS или CBS-FBS (0,3-0,5-1,0-1,5-2,0% объемного веса) и FBS (0,1-0,2-0,3-0,4-0,5% объемного веса). Считывание осуществлялось через 24 и 48 ч инкубации при температуре 37° C.

Устойчивость к последовательному действию кислоты и желчи
Имитацию транзита по ЖКТ проводили по методике Haller и соавт. (2001). Споры вначале инкубировали при рН 2,0-3,0 в физиологическом растворе в течение 1-2 ч, затем помещали в 1% желчный бульон (CBS). Начальная концентрация спор составляла 10⁷/мл (Ciffo et al., 1987).

Микроаэрофильный и анаэробный рост
Опыты проводили в анаэробной системе GasPak с применением коммерческих газогенерирующих комплектов CampyGen CN25 (микроаэрофильный рост) и AnaeroGen AN25 (анаэробный рост), полученных от компании Oxoid (Англия). Споры высевали в ПБ или ПА и инкубировали на протяжении 24-48 ч при температуре 37° C. Анаэробный рост также изучали с применением тех же сред, но с добавлением NaNO₃ 1 г/л.

Результаты
Влияние pH на кинетику роста
Штаммы B. clausii исследовали на предмет способности развиваться в щелочной среде, что является важной таксономической характеристикой вида. Была подтверждена устойчивость всех исследованных бактерий к воздействию щелочи, а также были отмечены незначительные различия между штаммами. В таблице 1 показано, что значение рН влияет как на время задержки, так и на темп роста в экспоненциальной фазе. В отличие от штаммов N/R и T штаммы O/C и SIN показывали краткое время задержки при pH 7,0, тогда как все штаммы показывали сокращение времени жизни поколения при переходе из нейтральной среды в щелочную.
В щелочной среде (pH 8,0 и 10,0) темпы роста штаммов O/C, N/R, SIN и T были схожими, тогда как при pH 7,0 темпы роста штаммов O/C и SIN были больше (рис. 1). После 24 ч инкубации культуры, полученные из смешанного инокулята MIX, показали схожие темпы роста в щелочной и нейтральной средах. Это означает, что рост MIX при pH 7,0 главным образом происходил за счет штаммов O/C и SIN. Темпы роста контрольного штамма DSM 8716Т были схожими с таковыми пробиотических штаммов, следовательно, pH 8,0 является оптимальным для их роста.

Устойчивость к действию желчи
При применении CBS-FBS наблюдалась различная степень устойчивости. МИК конъюгированных солей и смеси CBS-FBS для четырех пробиотических штаммов были большими, чем 2,0%, тогда как для B. clausii DSM 8716^Т значения МИК составляли соответственно 2,0 и 1,5% для CBS и FBS. Ингибирующее действие свободных солей было в десять раз большим, чем действие CBS и смеси CBS-FBS. Полученные в результате МИК свободных солей составляли 0,1 и 0,2% через 24 и 48 ч соответственно. Все рассматриваемые бактерии были способны развиваться в ПБ, содержащем 0,5 и 1% CBS, даже если достигнутые через 24 ч инкубации концентрации клеток были в целом ниже, чем концентрации контрольных культур в отсутствие желчи (рис. 2).
На рисунке 3 показано, что в присутствии конъюгированных солей рост не прекращался, а только задерживался и существенным образом не уменьшался. Эффект концентрации желчи проявляется как при увеличении времени задержки, так и при уменьшении времени роста при изменении содержания желчи от 0 до 0,5% и 1%. Поведение пробиотических штаммов было схо-жим с таковым контрольного штамма DSM 8716Т. Похожие профили роста были получены при изучении действия смеси CBS-FBS.
Сравнивая показатели роста пробиотических штаммов по отношению к контрольным в отсутствие желчи (рис. 4), мы подтвердили, что они были выше в присутствии CBS, чем в присутствии FBS. Устойчивость пробиотических штаммов к действию желчи не отличалась от таковой B. clausii DSM 8716^Т, и она была более очевидной, чем устойчивость B. subtilis ATCC 6051^Т.
Действие совокупности кислот и желчи на размножение спор
Предварительный мониторинг подтвердил 2-часовую устойчивость пробиотических спор к действию кислот при значении pH до 2,0, тогда как вегетативные клетки сохраняли устойчивость при pH 6,0 и были подвижными при pH ≤4,0. В ходе пробы с имитацией транзита по ЖКТ было установлено, что у всех исследованных штаммов реакция на воздействие кислот и желчи была схожей. В частности, на рисунке 5 показано, что количество клеток, подсчитанное после предварительной инкубации спор при pH 2,0 на протяжении 2 ч, было схожим с количеством клеток в необработанных контрольных суспензиях. При последующем воздействии смесью CBS-FBS имело место временное нарушение размножения спорами. Фактически после 1 ч воздействия количество клеток уменьшилось. Нарушение размножения было устранено увеличением времени инкубации до 24 ч.

Развитие в микроаэрофильных и анаэробных средах
В таблице 2 показано, что все изучаемые штаммы B. clausii и B. subtilis были способны развиваться в микроаэрофильных условиях в жидкой и твердой средах. В этих же средах при анаэробной инкубации роста не наблюдалось, однако четыре пробиотических штамма B. clausii и один штамм B. subtilis (ATCC 33677) отличались от прочих контрольных штаммов и могли развиваться в анаэробных условиях при добавлении в среду нитрата натрия.

Обсуждение
Подобно росту B. clausii в щелочной среде, описанному как типичный для этого вида (Fritze et al., 1990; Nielsen et al., 1995), наши результаты подтвердили размножение спорами, а также рост в нейтральной среде. Это поведение зависело от штаммов, и объемы роста, полученные для штаммов O/C и SIN, были больше, чем объемы, полученные для штаммов N/R, T и типового штамма (DSM 8716^Т). При использовании суспензии штаммов MIX (Энтерожермина), содержащей четыре штамма, рост не изменялся при значениях pH от 7,0 до 10,0, следовательно, объем роста при pH 7,0 обеспечивался главным образом штаммами O/C и SIN. Адаптация мультипробиотка Энтерожермины к pH может рассматриваться как важная характеристика пробиотической функции, так как pH варьирует от 5,5-6,0 в толстой (Ahn et al., 2003) до 8,0 в тонкой кишке (Huang, Adams, 2004).
Хорошо известно, что споры B. clausii в отличие от вегетативных клеток устойчивы к действию кислот. В настоящем исследовании было подтверждено их размножение и после комбинированного воздействия кислотами и желчью. Способность выдерживать действие желчи, которая прежде считалась прерогативой кишечной микрофлоры, важна для выживания бактерий в просвете кишечника. Таким образом, устойчивость B. clausii к действию желчи должна представлять собой первичный интерес с учетом отсутствия однозначных данных о размножении бацилл в пищеварительном тракте (Spinosa et al., 2000; Casula, Cutting, 2002). Все штаммы показали существенные темпы роста при инкубации в присутствии CBS и смеси желчных солей CBS-FBS. Следует отметить, что испытанные концентрации (до 1%) были выше значений соответственно в 0,3 и 0,5%, которые считаются критическими уровнями для хорошей и очень хорошей устойчивости для пробиотиков (Charteris et al., 1998; Hyronimus et al., 2000). В отличие от лактобацилл и бифидобактерий, относительно кото-рых сообщалось об изменениях в штаммах в результате воздействия желчи (Charteris et al., 2000), между пробиотическими и совокупными штаммами B. clausii не было обнаружено соответствующих различий. Кроме того, устойчивость к действию желчи, которая наблюдалась у B. clausii, была выше устойчивости B. subtilis, и мы рассматри-ваем это как неотъемлемое свойство спорообразующих бацилл, которое у разных видов разное. Фактически, обращаясь к литературным данным, МИК желчи может оцениваться как 0,1; 0,7% и более 1% соответственно для штаммов Bacillus laevolacticus, Bacillus racemilacticus и Bacillus coagulans (Hyronimus et al., 2000).
Учитывая высокую чувствительность вегетативных клеток к FBS, мы наблюдали МИК ниже 0,1% после 24 ч и равные 0,2% после 48 ч, что свидетельствует о том, что первоначальный стресс был преодолен. Однако следует помнить, что в желчи человека содержатся главным образом CBS (De Boever, Verstraete, 1999).
Рост и размножение в условиях анаэробиоза, когда штаммы выращивались в азотной среде, также подтверждают способность В. clausii адаптироваться к среде кишечника. Последнее свойство, характерное и для строгого аэроба B. subtilis (Nakano, Zuber, 1998; Cruz Ramos et al., 2000; Marino et al., 2000), можно объяснить высокой концентрацией цитохромов в алкалофильных бациллах, несмотря на то что функции этих ферментов точно не определены (Yumoto et al., 1997).
Таким образом, описанные физиологические свойства исследованных штаммов B. clausii, входящих в состав мультипробиотика Энтерожермина, подтверждают, что споры этих штаммов способны размножаться, а вегетативные формы – выживать во время транзита по желудочно-кишечному тракту, что свидетельствует об их высокой пробиотической ценности.

Список литературы находится в редакции.

Journal of Applied Microbiology 2006;
101: 1208-1215