Радиопротекторные свойства блокаторов гистаминовых Н2-рецепторов: настоящее и будущее

Со времени открытия радиопротекторного эффекта цистеина в 1949 г. продолжаются активные поиски новых веществ, обладающих подобным свойством. Ранние исследования в области синтеза радиопротекторов концентрировались вокруг аналогов цистеина, однако вскоре оказалось, что цистеин и его аналоги токсичны для человека. В начале 1950-х гг. была синтезирована аминоэтилизотиомочевина (АЭТ) и был сделан вывод, что радиопротекторность серы обусловливают структурные особенности ее строения. В то время было определено, что наиболее эффективными являются структуры, содержащие сульфгидрильную группу (-SH).

Из 4 тыс. химических соединений с подобными характеристиками убедительные радиопротекторные свойства были обнаружены только у таких аминотиолов, как В-меркаптоэтиленамин (МЭА), АЭТ и WR-2721. Однако, помимо того, что эти вещества эффективны в больших дозах, они вызывают различные побочные явления. WR-2721 c генерическим названием Этиофос в США и Гаммафос в России имеет коэффициент снижения дозы (КСД) 2,7 для γ-излучения у мышей после внутриперитонеальной инъекции доз от 100 до 800 мг/кг. Исследование на мышах летальной дозы (LD)_50/30 показало КСД до 2,1 для АЭТ в дозе 400 мг/кг. Исследования показали, что АЭТ легко проникает во все ткани – здоровые и злокачественные. В отличие от АЭТ, WR-2721 показывал КСД 2,4 для мышечной ткани и 2,7 – для кожи, но не изменял действия радиации на солидные опухоли. Кроме того, измеримая системная токсичность, проявляющаяся гипотензией, тошнотой и рвотой, выявленная при клинических испытаниях, ограничивает применение этого радиопротектора при лечении онкологических заболеваний.
По этой причине поиск эффективных и безопасных радиопротекторов подхлестнул интерес к другим веществам. Некоторые из природных антиоксидантов, например такие флавоноиды, как производные бензо-γ-пирона, могут угнетать образование свободных радикалов. Недавно радиопротекторный эффект структурно измененных флавоноидов и производных 2-иминотазолидина изучался на мышах. Эти вещества показали КCД <1,5 и оказались токсичными.
Доказана эффективность натуральных и синтетических иммуномодуляторов при адъювантной терапии. Для лечения пептической язвы мы использовали циметидин, который обладает потенциальным иммуномодулирующим эффектом и предупреждает повреждение лимфоидной ткани при γ-облучении. Циметидин имеет КСД >1,5 для дозы облучения 1-8 Гр. Он показал свою эффективность в предупреждении повреждающего действия γ-лучей и низких доз нейтронного излучения.
В этом исследовании были использованы и другие представители блокаторов гистаминовых Н₂-рецепторов – ранитидин и фамотидин. С помощью микронуклеарного теста in vivo и метафазного анализа in vitro определялась их радиопротекторная способность. На рисунке 1 показана химическая структура указанных препаратов. Микронуклеарный тест, разработанный Шмидтом и его коллегами, – чувствительный и достоверный метод оценки генетических изменений, продуцируемых химическими и физическими агентами in vivo. Метафазный анализ лимфоцитов периферической крови человека применяли для определения in vitro необходимости метаболических изменений изучаемых препаратов для проявления их радиопротекторных свойств.

Микронуклеарный анализ
Мыши-самцы линии BALB/c были доставлены из института Рази, Карай. Они содержались в контролируемых условиях (чередование светлого и темного времени суток по 12 ч, температура 22±2°С) в университетском виварии и получали стандартное питание и воду по желанию. Все эксперименты проводились с 8-недельными мышами. Циметидин, фамотидин и ранитидин были разведены в изотоническом растворе и инъецированы интраперитонеально в различных концентрациях за 2 ч до облучения, чтобы препарат успел аккумулироваться в костном мозге.
Облучение проводилось с помощью прибора γ-излучения Co-60 со скоростью 99,77 сГр/мин, РИП (расстояние «источник-поверхность») – 80 см. Контрольная и исследуемая группы животных подверглись γ-облучению в дозе 2 Гр. Через 24 ч после облучения были приготовлены мазки из суспензии клеток костного мозга бедренной кости мышей. Мазки были окрашены по Мей-Грюнвальду и Гимзе для идентификации полихроматофильных (ПХЭ) и нормохроматофильных (НХЭ) эритроцитов. В каждом из образцов насчитывалось до 1500 ПХЭ, отношение ПХЭ/(ПХЭ+НХЭ) определялось для каждой дозы радиации с целью оценки влияния лучевой терапии и медикаментов на пролиферацию костного мозга.

Метафазный анализ
Гепаринизированные образцы крови были получены от здоровых мужчин, не принимавших препараты и не подвергавшихся облучению в течение последнего месяца. Мы культивировали 0,4 мл цельной крови в 4,5 мл PRMI-1640 с добавлением 15% фетальной плазмы теленка, антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) и L-глутамина. В роли митогена был использован раствор фитогемагглютинина (ФГА) в концентрации 5 мкг/мл, который добавляли в клеточные культуры после проведенной медикаментозной и лучевой терапии.
За 1 ч перед γ-облучением в дозе 3 Гр источником излучения Co-60 (73,7 сГр/мин) к лимфоцитам было добавлено 100 мкмоль/л циметидина, ранитидина или фамотидина.
Все образцы крови (как с добавлением медикаментов, так и без) были облучены за 1 ч до добавления ФГА, то есть лимфоциты цельной крови облучались в G0-фазе клеточного цикла. Доза препаратов 100 мкмоль/л, используемая в этом исследовании, была подобна дозе, применяемой в двух других исследованиях, в которых изучались антирадикальные свойства этих препаратов. Через 48 ч после прохождения фазы инициации к культуре добавили колхицина 2 мкг/мл на 2 ч для задержки развития клеток в метафазе. Клетки были собраны и обработаны гипотоническим раствором KCl в течение 10 мин, а затем фиксированы смесью Карно. Мазки были приготовлены высушиванием на воздухе и окрашены 5% раствором Гимзы. В каждом из образцов 100 митозов анализировались на наличие либо отсутствие хромосомных аббераций. Повреждения были классифицированы в соответствии с международной цитогенетической номенклатурой приобретенных хромосомных аберраций (ISCN). Основные хромосомные абберации в этом исследовании относились к хромосомному типу, а именно – изохроматидные пробелы, изохроматидные поломки и хромосомные обмены, в основном дицентрического типа. Частота изохроматидных пробелов была слишком низкой (около 1-1,5%), поэтому они не учитывались при статистическом анализе.

Результаты
Результаты, полученные в ходе микронуклеарного теста, продемонстрированы в таблице 1, результаты метафазного анализа – на рисунке 2. Как вытекает из таблицы 1, доза γ-излучения 2 Гр эффективно индуцировала возникновение микронуклеарных ПХЭ (МНПХЭ, 100,7 против 5,5 в группе контроля) и привела к уменьшению соотношения ПХЭ/(ПХЭ+НХЭ) с 0,44 до 0,28. Предварительное лечение циметидином обусловило значительное уменьшение количества МНПХЭ, что было очевидно продемонстрировано при дозе 15 мг/кг, в которой был показан КСД 1,61 (табл. 2). Ранитидин в дозах 2,5 и 5 мг/кг и фамотидин – 0,75 и 1,5 мг/кг более эффективно снижали количество МНПХЭ. Эти результаты свидетельствуют о том, что оба препарата более эффективны, чем циметидин, к тому же в меньших концентрациях. Поскольку в дозе 1,5 мг/кг фамотидин показывает такой же эффект, что и ранитидин в дозе 5 мг/кг, можно предположить, что фамотидин более эффективен в снижении МНПХЭ, чем ранитидин. Однако циметидин, в отличие от фамотидина и ранитидина, приводит к увеличению соотношения ПХЭ/(ПХЭ+НХЭ), что подразумевает снижение индуцированной радиацией цитотоксичности. КСД, измеренный для каждой из доз препарата, продемонстрирован в таблице 2 и показывает большее значение для фамотидина и ранитидина при низких дозах.
Изучение метафазы облученных лимфоцитов in vivo в дозе 3 Гр γ-излучения в присутствии 100 ммоль/л лекарств продемонстрировало результаты, подобные таковым in vitro. Все препараты эффективно снижали частоту γ-индуцированных хромосомных аберраций (рис. 2) с КСД 1,45-1,95. Фамотидин оказался более эффективным, чем два других препарата, показав КСД 1,95 (табл. 2).

Обсуждение
Для лечения пептической язвы применяются такие блокаторы гистаминовых Н₂-рецепторов, как циметидин, ранитидин и фамотидин. Кроме антацидных свойств и угнетения секреции пепсина, они способны захватывать гидроксильные радикалы. Эти вещества хорошо поглощают HОСl, синтезируемый нейтрофилами из Сl^- c помощью миелопероксидазы (Ching u Coal). Исследования радиационного воздействия показали, что свободные радикалы являются факторами, реализующими непрямое действие радиации. Результаты, полученные для циметидина, сопоставимы с результатами исследователей Кариотта и Грува, которые обнаружили, что АЭТ уменьшает продукцию микронуклеаров в костном мозге мышей при облучении их γ-лучами в дозе 0-2,5 Гр. Однако эти авторы использовали значительно более высокие дозы АЭТ (300 мг/кг) для получения радиопротекторного эффекта. В норме в костном мозге, почках и печени млекопитающих содержатся такие ферменты, как глутатионредуктаза и каталаза, которые участвуют в продукции пероксида водорода. Было показано, что ингибирование этих ферментов приводит к повышению образования микронуклеаров. Кроме того, лимфоциты CD4+ принимают участие в индукции глутатионредуктазы и каталазы. Гиффорд со своими коллегами показал, что циметидин повышает пролиферативные свойства лимфоцитов. Это и многие другие исследования подтверждают, что назначение циметидина до облучения приводит к ингибированию Т-супрессоров и повышает пролиферацию CD4+ лимфоцитов. Этот процесс вызывает продукцию глутатионредуктазы и каталазы, которые предотвращают повреждения ДНК и таким образом снижают изменения, вызванные радиацией. Как показано в таблице 2, сходный КСД, полученый in vitro (1,5) и in vivo (1,6), может быть показателем потенциального радиопротекторного действия циметидина.
Ранитидин и фамотидин не оказывают иммуномоделирующего влияния. Однако была показана их способность захватывать радикалы кислорода. Эффекты in vitro и in vivo для обоих препаратов были одинаковыми, более того, небольшое количество препарата проникает в костный мозг, а in vitro в момент облучения его концентрация в межклеточном пространстве очень высока. Уменьшение частоты хромосомных аберраций лимфоцитов показывает, что все препараты могут снижать повреждающее действие радиации благодаря механизму захвата радикалов. Кроме того, в этом исследовании было продемонстрировано, что фамотидин более эффективен, чем другие блокаторы гистаминовых Н₂-рецепторов (рис. 2), в соотношении КСД.
Был сделан вывод, что наличие атомов серы в структуре является важным фактором, обусловливающим их свойство захватывать радикалы (рис. 1).
Радиопротекторы, которые могут применяться пациентами, проходящими радиотерапию, работающими с радиоактивными веществами, на ядерных полигонах должны соответствовать следующим критериям:
• обеспечивать хорошую защиту от острых и хронических радиационных повреждений (КСД>1,5);
• иметь форму для орального применения и обладать способностью быстрой абсорбции и распространения в органах и тканях;
• не иметь значительных токсических побочных явлений;
• быть доступными и недорогими;
• быть химически стабильными, что облегчает их использование и хранение.
Во всех исследованиях блокаторы гистаминовых Н₂-рецепторов применялись в таблетированной форме и имели широкое применение в клинической практике для лечения пептической язвы без каких-либо значимых очевидных побочных явлений даже в дозах, значительно превышающих терапевтические. Эти свойства делают их кандидатами на использование в качестве радиопротектора, особенно в процессе радиотерапии пациентов, подверженных риску поражения костного мозга.

I Radial Res. 2003; 44;145-149

Перевод с англ. Ольги Татаренко